马力欧和路易吉是生活在布鲁克林的两名水管工，他们刚刚成立了自己的小公司，但很显然，他们的家人并不完全支持兄弟两人的这份事业。某日，在工作中，马力欧和路易吉被水管吸入到了一个光怪陆离的世界之中，两人在旅途中被迫分开，马力欧来到了由碧姬公主统治的蘑菇王国，而路易吉则不幸地被传送到了由酷霸王统治的库巴王国。 此时，酷霸王正准备大举进攻蘑菇国，掳走公主并和她结婚，在这个节骨眼上，马力欧的出现带给了碧姬公主希望，她带着马力欧来到了丛林王国，请求那里的国王和王子的支援。

该片改编自任天堂发行的《超级马力欧》系列游戏，讲述了水管工马力欧和他的弟弟路易吉在地下修理一条主水管时被意外传送进一条神秘管道，由此误入一个全新的神奇世界并展开了冒险之旅的故事。